V akademickém roce 2018/2019 proběhla na Oddělení klinické hematologie Ústavu laboratorní diagnostiky ve Fakultní nemocnici Ostrava studie s názvem „Stanovení protrombinového testu a aktivovaného parciálního tromboplastinového testu na přístroji CoaguChek® Pro II“. Tato studie byla hlavním tématem bakalářské práce studenta Lékařské fakulty Ostravské univerzity, studujícího bakalářský obor „Zdravotní laborant“.
Úvod
![](/ckfinder/userfiles/files/zkusenosti_z_laboratori/Porovn%C3%A1n%C3%AD%20PT%20a%20aPTT/image.png)
Laboratorní diagnostika přináší pro klinickou medicínu stěžejní informace. Díky laboratorním výsledkům je lékař schopen blíže klasifikovat případnou patologii a vytvořit optimální diagnostický a léčebný plán. Většina vyšetření se provádí v klinických laboratořích. Vedle nich roste počet těch, která se měří v režimu tzv. POCT. Přístroje POCT (Point-of-care testing) jsou určeny k provádění laboratorních vyšetření v přímé blízkosti pacienta. Významným přínosem je doba odezvy, která je kratší než doba odezvy laboratoře. Proto nacházejí tyto přístroje uplatnění zejména v urgentní medicíně, ordinacích praktických lékařů a s výhodou jsou také používány u vybraných pacientů pro monitorování léčby v domácím prostředí. Spektrum testů v režimu POCT je široké. Je možné měřit krevní plyny, některé parametry krevního obrazu, základní koagulační testy a další parametry. V současné době je na trhu k dispozici velký výběr různých typů POCT přístrojů. Pro běžnou klinickou praxi je ale důležité, aby pravdivost vydávaných výsledků byla podložena a ověřována v externím hodnocení kvality, aby byl zaveden dobře fungující systém vnitřní kontroly kvality včetně mezipřístrojové porovnatelnosti, tedy porovnatelnosti výsledků mezi POCT a centrální laboratoří. Tato práce se zaměřila na porovnání dvou nejběžněji vyšetřovaných koagulačních testů (PT, aPTT), které mohou být vyšetřovány jak na automatických koagulačních analyzátorech (cobas t 511, Sysmex CS-5100), tak na přístroji POCT (CoaguChek® Pro II). Byly porovnávány analytické charakteristiky jednotlivých systémů (přesnost měření za podmínek opakovatelnosti v sérii a nejistoty měření). Cílem práce tedy bylo komplexní zhodnocení vyšetřování PT a aPTT pomocí POCT přístroje a dvou koagulačních analyzátorů.
Použité přístroje
![](/ckfinder/userfiles/files/zkusenosti_z_laboratori/Porovn%C3%A1n%C3%AD%20PT%20a%20aPTT/obr1.png)
Koagulační analyzátor Sysmex CS-5100 je využíván pro měření rutinních koagulačních testů na Oddělení klinické hematologie Ústavu laboratorní diagnostiky ve Fakultní nemocnici Ostrava. Firma Roche Diagnostics s.r.o. zapůjčila přístroj POCT CoaguChek® Pro II a koagulační analyzátor cobas t 511. Na obrázku č. 1 je zobrazen POCT přístroj CoaguChek® Pro II firmy Roche. Umožňuje vyšetřit protrombinový test (PT-INR) a aktivovaný parciální tromboplastinový test (aPTT). Přístroj vydává výsledky PT-INR v rozmezí 0,8–8, resp. 20–130 sekund u aPTT. Součástí přístroje je čtečka čárových kódů, konektor pro napájecí adaptér, otvor pro kódovací čip a otvor, do něhož se umísťuje testovací proužek (CoaguChek PT Test či Coagu-Chek aPTT Test). Proužky CoaguChek® Test obsahují lyofilizované reagencie (aktivátory, peptidový substrát a další komponenty). Aplikací krve na proužek se zahájí proces koagulace vedoucí k vytvoření enzymu trombinu. Od tohoto okamžiku se začne měřit koagulační čas. Trombin štěpí peptidový substrát a tím se následně vytváří elektrochemický signál. V závislosti na čase, který uplynul od prvního signálu, je signál převeden algoritmem do odpovídajícího formátu výsledku pro PT-INR (-) a aPTT (s). Pro každý test je potřeba pouhých 8 μL krve. Krev nesmí obsahovat protisrážlivá činidla (např. EDTA, citrát, oxalát, heparin).
Měření musí být provedeno do 30 sekund od okamžiku odběru u venózní či arteriální krve, resp. do 15 sekund u odběru kapilární krve. Přístroj CoaguChek® Pro II má několik vestavěných funkcí kontroly kvality:
- kontrola elektronických součástí a funkcí při každém zapnutí přístroje,
- kontrola teploty testovacího proužku v průběhu měření,
- kontrola data exspirace a šarže testovacího proužku podle údajů z kódovacího čipu,
- průběžná kontrola kvality u jednotlivých proužků.
![](/ckfinder/userfiles/files/zkusenosti_z_laboratori/Porovn%C3%A1n%C3%AD%20PT%20a%20aPTT/obr2.png)
K dispozici jsou i atestované firemní kapalné kontrolní materiály CoaguChek PT Controls a CoaguChek aPTT Controls na dvou hladinách, tj. normální a patologické. Na obrázku č. 2 je zobrazen koagulační analyzátor firmy Roche cobas t 511. Jedná se taktéž o plně automatizovaný koagulační analyzátor, který je určen k diagnostickému použití pro analýzu koagulačních, chromogenních a imunoturbidimetrických metod ve středních či velkých klinických laboratořích. Přístroj stanovuje koagulační čas PT do 80 sekund v základním nastavení testu, resp. 180 sekund v nastavení s prodlouženou dobou měření. Rozsah stanovení koagulačního času pro aPTT je až 174 sekund v základním nastavení testu, možnost prodlouženého měření pro tuto aplikaci přístroj nenabízí. Tento analyzátor je schopen zpracovat až 195 PT/aPTT testů za hodinu. Analyzátor jako jediný na trhu umožňuje automatickou rekonstituci reagencií díky systému reagenčních kazet, na rozdíl od konkurenčních výrobců, kteří reagencie dodávají v samostatných lahvičkách. Tento prvek výrazně minimalizuje nutnost manuálních zásahů při obsluze analyzátoru. Dalším významným inovativním prvkem je chlazený zásobník na reagencie, který je součástí analyzátoru.
Na obrázku č. 3 je zobrazen koagulační analyzátor Sysmex CS-5100. Jedná se o plně automatizovaný koagulační analyzátor, který je určen k diagnostickému použití pro analýzu koagulačních, chromogenních, imunoturbidimetrických a agregačních metod ve velkých klinických laboratořích. Přístroj umožňuje stanovit koagulační čas PT a aPTT v rozsahu až 170 sekund v základním nastavení testu, resp. do 300 sekund (test PT) a 600 sekund (test aPTT) v nastavení s prodlouženou dobou měření. Výkon analyzátoru dosahuje až 400 PT/ aPTT testů za hodinu. Inovativní prvek tohoto analyzátoru představuje možnost stanovení agregačních i koagulačních metod pouze v jedné analytické platformě. Koagulační analyzátory cobas t 511 a Sysmex CS-5100 byly v rámci této studie vedeny jako referenční, neboť se jedná o koagulační analyzátory měřící s vysokou přesností a správností. Naopak POCT přístroje mají obecně horší výkonnostní charakteristiky. Všechny tři používané reagencie pro stanovení PT, tj. testovací proužky PT (CoaguChek® Pro II), PT Rec (cobas t 511) firmy Roche s.r.o. a Dade Innovin firmy Siemens Healthcare, s.r.o., (CS-5100), jsou založené na lidském rekombinantním tromboplastinu. Jedná se o reagencie, které mají obvykle hodnoty ISI blízké 1,0 a zpravidla se pohybují v intervalu 0,95–1,05. Všechny tři reagencie navíc obsahují látku neutralizující heparin. Detailní složení reagencií je uvedeno v tabulce č. 1. Tabulka č. 2 uvádí vliv jednotlivých interferujících látek na stanovení PT. Stanovení PT pomocí CoaguChek® Pro II neovlivňuje hemoglobin a přítomnost lipidů až do hodnoty 1 000 mg/dL, dále heparin (UFH i LMWH) až do hodnoty 3,0 IU/mL a pouze bilirubin ovlivňuje stanovení již v koncentraci nad 30 mg/dL.
![](/ckfinder/userfiles/files/zkusenosti_z_laboratori/Porovn%C3%A1n%C3%AD%20PT%20a%20aPTT/obr3.png)
![](/ckfinder/userfiles/files/zkusenosti_z_laboratori/Porovn%C3%A1n%C3%AD%20PT%20a%20aPTT/tab1.png)
![](/ckfinder/userfiles/files/zkusenosti_z_laboratori/Porovn%C3%A1n%C3%AD%20PT%20a%20aPTT/tab2.png)
Složení reagencií pro stanovení aPTT je popsáno v tabulce č. 3. Reagencie aPTT Screen (cobas t 511) a Pathromtin SL (Sysmex CS-5100) používají jako kontaktní aktivátory křemičitany. Naproti tomu v testovacích proužcích pro aPTT (CoaguChek® Pro II) působí jako aktivátor kaolin. Všechny tři reagencie dále obsahují různé směsi fosfolipidů, které ovlivňují charakter testu a jeho citlivost vůči koagulačním faktorům, lupus antikoagulans či heparinu. Tabulka č. 4 uvádí vliv jednotlivých interferujících látek na stanovení aPTT. Z uvedených údajů vyplývá, že stanovení aPTT pomocí CoaguChek® Pro II neovlivňuje přítomnost lipidů až do koncentrace 1 000 mg/dL, což je výrazně vyšší hodnota ve srovnání s reagenciemi používanými na obou koagulačních analyzátorech. Bilirubin ovlivňuje stanovení aPTT přístrojem CoaguChek® Pro II prakticky skoro stejně jako při analýze pomocí reagencie Pathromtin SL. Naopak hemoglobin negativně ovlivňuje testy prováděné na přístroji CoaguChek® Pro II v koncentraci již nad 400 mg/dL, což je výrazně nižší hodnota než u obou koagulačních analyzátorů. Tento fakt je nutné brát v úvahu zejména při analýze hemolytických vzorků.
![](/ckfinder/userfiles/files/zkusenosti_z_laboratori/Porovn%C3%A1n%C3%AD%20PT%20a%20aPTT/tab3.png)
![](/ckfinder/userfiles/files/zkusenosti_z_laboratori/Porovn%C3%A1n%C3%AD%20PT%20a%20aPTT/tab4.png)
Metodika
Datový soubor obsahoval 64 vzorků od fyziologických až po silně patologické, tj. vzorků pacientů na antikoagulační léčbě (warfarin, heparin, fraxiparin). Žilní krev se odebírala do zkumavek značky Sarstedt s 3,2% citrátem sodným. Plazma se připravila centrifugací po dobu 7 minut při 2 500 g a následně vyšetřila na obou analyzátorech, tj. cobas t 511 a CS-5100. Na přístroji CoaguChek® Pro II se analyzovala žilní krev odebraná do zkumavek značky Sarstedt bez protisrážlivého činidla.
Vzorky byly analyzovány na Oddělení klinické hematologie Ústavu laboratorní diagnostiky ve Fakultní nemocnici Ostrava v období 12/2018–04/2019. U všech vzorků se vyšetřoval PT-INR a aPTT. Grafické a statistické vyhodnocení se provedlo pomocí statistického softwaru MedCalc, verze 18.2.1, (Passing-Bablokova regresní analýza, Bland-Altmanův rozdílový diagram). Vyloučily se extrémně odlehlé hodnoty, popř. vzorky, u kterých z nějakého důvodu chyběl výsledek. Počty dat v souborech se proto liší. Toto se doplnilo o deskriptivní statistiku. Nakonec se provedl výpočet procentuálních odchylek měření Di (%) pro PT-INR, které se porovnaly s povolenými odchylkami měření Dmax (%) uváděnými firmou SEKK.
Výsledky a diskuse
Protrombinový test (PT-INR) byl změřen celkem u 64 vzorků, z tohoto počtu bylo pro vyhodnocení použito 62 vzorků. Dva vzorky musely být vyloučeny z důvodu výrazně odlehlých hodnot výsledků. Passing-Bablokův graf regresní závislosti a Bland-Altmanův diagram jsou znázorněny na obr. č. 4 a 5 pro první porovnávanou dvojici (Sysmex CS-5100 a Coagu-Chek® Pro II), resp. na obr. č. 6 a 7 pro druhou porovnávanou dvojici (cobas t 511 a CoaguChek® Pro II).
![](/ckfinder/userfiles/files/zkusenosti_z_laboratori/Porovn%C3%A1n%C3%AD%20PT%20a%20aPTT/obr_4_a_5.png)
Obr. č. 5 (vpravo): Bland-Altmanův diagram pro PT-INR (CS-5100 a CoaguChek® Pro II)
![](/ckfinder/userfiles/files/zkusenosti_z_laboratori/Porovn%C3%A1n%C3%AD%20PT%20a%20aPTT/obr_6_a_7.png)
Obr. č. 7 (vpravo): Bland-Altmanův diagram pro PT-INR (cobas t 511 a CoaguChek® Pro II)
Tabulka č. 5 obsahuje deskriptivní statistiku a parametry Passing-Bablokovy regresní analýzy PT-INR. Hodnoty parametrů mezi oběma analyzátory a POCT přístrojem CoaguChek® Pro II se výrazně neliší (např. vypočten medián 1,12 pro Sysmex CS-5100, dále 1,19 pro cobas t 511 a 1,2 pro CoaguChek® Pro II). Byla zjištěna statistická významnost úseku (systematická chyba) u obou porovnávaných dvojic. Naopak statistická významnost směrnice (proporcionální chyba) byla zjištěna jen u dvojice CS-5100 a CoaguChek® Pro II. Je možné říci, že ideálnímu průběhu regresní závislosti, tj. rovnici y = x, se více přibližuje dvojice cobas t 511 a CoaguChek® Pro II. Dále byly vypočítány procentuální odchylky měření, které u 100 % porovnávaných dvojic Sysmex CS-5100 a CoaguChek® Pro II, resp. u 96,8 % pro cobas t 511 a CoaguChek® Pro II, byly menší než deklarovaná hodnota (Dmax = 20 % dle SEKK). Klinicky tedy není významný rozdíl ve výsledcích porovnávaných dvojic. Výsledky PT-INR mezi analyzátory Sysmex CS-5100, cobas t 511 a POCT přístrojem CoaguChek® Pro II se příliš neliší, což potvrzují i hodnoty korelačních koeficientů blížící se 1,0 (0,945, resp. 0,947). Je nutné zdůraznit, že určitou chybu do vyhodnocení vnáší také skutečnost, že CoaguChek® Pro II zaokrouhluje výsledky PT-INR pouze na jedno desetinné místo.
![](/ckfinder/userfiles/files/zkusenosti_z_laboratori/Porovn%C3%A1n%C3%AD%20PT%20a%20aPTT/tab5.png)
![](/ckfinder/userfiles/files/zkusenosti_z_laboratori/Porovn%C3%A1n%C3%AD%20PT%20a%20aPTT/tab6.png)
Aktivovaný parciální tromboplastinový test (aPTT) byl změřen celkem u 56 vzorků. Všechna data byla použita pro vyhodnocení. Passing-Bablokův
graf regresní závislosti a Bland-Altmanův diagram jsou znázorněny na obr. č. 8 a 9 pro první porovnávanou dvojici (Sysmex CS-5100 a CoaguChek® Pro II), resp. na obr. č. 10 a 11 pro druhou porovnávanou dvojici (cobas t 511 a CoaguChek® Pro II). Tabulka č. 6 popisuje deskriptivní statistiku a parametry Passing-Bablokovy regresní analýzy aPTT. Hodnoty parametrů mezi oběma analyzátory a POCT přístrojem CoaguChek® Pro II se výrazně neliší (např. vypočten medián 35,1 sekundy pro Sysmex CS-5100, 35,2 sekundy pro cobas t 511 a 32,8 sekundy pro Coagu-Chek® Pro II). Opět byla zjištěna statistická významnost úseku (systematická chyba) u obou porovnávaných dvojic. Naopak statistická významnost směrnice (proporcionální chyba) byla zjištěna jen u dvojice cobas t 511 a CoaguChek® Pro II. Je možné říci, že ideálnímu průběhuregresní závislosti, tj. rovnici y = x, se tentokrát více přibližuje dvojice CS-5100 a CoaguChek® Pro II.
![](/ckfinder/userfiles/files/zkusenosti_z_laboratori/Porovn%C3%A1n%C3%AD%20PT%20a%20aPTT/obr8_a_9.png)
Obr. č. 9 (vpravo): Bland-Altmanův diagram pro aPTT (s) (CS-5100 a CoaguChek® Pro II)
![](/ckfinder/userfiles/files/zkusenosti_z_laboratori/Porovn%C3%A1n%C3%AD%20PT%20a%20aPTT/obr_10_a_11.png)
Obr. č. 11 (vpravo): Bland-Altmanův diagram pro aPTT(s) (cobas t 511 a CoaguChek® Pro II)
Vzhledem k tomu, že firma SEKK nestanovuje pro výsledky aPTT vyjádřené v sekundách hodnotu Dmax, není v Bland-Altmanově grafu zobrazena. Je nutné zdůraznit, že CoaguChek® Pro II vydává výsledky aPTT pouze v sekundách. Pro hodnocení aPTT by bylo jistě výhodnější vyjádření výsledků aPTT jako poměru času pacienta a času normálu. Výsledky aPTT mezi analyzátory Sysmex CS-5100, cobas t 511 a POCT přístrojem CoaguChek® Pro II korelují méně než výsledky PT-INR. To potvrzují i nižší
hodnoty korelačních koeficientů (0,881, resp. 0,901). Vyhodnocení aPTT bylo negativně ovlivněno porovnáním výsledků uvedených v sekundách a také různým složením reagencií, které byly pro analýzy použity. Tyto dva faktory způsobily do jisté míry pozorovanou heterogenitu výsledků.
Externí hodnocení kvality
Pracoviště se zúčastnilo externího hodnocení kvality cyklu INRP1/19 – Měření INR systémy POCT firmy SEKK. Výsledky kontrolních vzorků se nacházely v povoleném intervalu a pracoviště získalo osvědčení o účasti. Odchylka měření byla u obou vzorků menší než 1 %, což je vynikající výsledek. Kvantitativní výsledky a osvědčení o účasti tohoto cyklu EHK zachycují obr. č. 12 a 13. Firma SEKK zatím nenabízí kontrolní vzorky pro měření aPTT na POCT přístrojích.
Opakovatelnost měření v sérii
Dalším cílem práce bylo porovnání hodnot variačních koeficientů mezi analyzátory a POCT přístrojem v rámci tzv. opakovatelnosti měření v sérii. Tento parametr představuje těsnost shody mezi naměřenými hodnotami veličiny získanými opakovanými měřeními v krátkém časovém intervalu na stejném objektu nebo na podobných objektech za specifikovaných podmínek. Pro účely tohoto porovnání byl použit vybraný fyziologický vzorek, který byl postupně změřen na obou analyzátorech a přístroji POCT šestkrát po sobě. Průměrné hodnoty výsledků, velikosti směrodatných odchylek (SD) a variační koeficienty (CV) jsou uvedeny v tabulkách č. 7 (PT-INR) a č. 8 (aPTT). U obou testů byly hodnoty CV získané měřením na koagulačních analyzátorech výrazně nižší než u POCT, což potvrdilo náš vstupní předpoklad, že POCT přístroje mají obecně horší výkonností charakteristiky.
![](/ckfinder/userfiles/files/zkusenosti_z_laboratori/Porovn%C3%A1n%C3%AD%20PT%20a%20aPTT/tab7.png)
![](/ckfinder/userfiles/files/zkusenosti_z_laboratori/Porovn%C3%A1n%C3%AD%20PT%20a%20aPTT/tab8.png)
Závěr
I přes rozdílné složení reagencií a specifické provozní možnosti analyzátorů cobas t 511, Sysmex CS-5100 a přístroje POCT CoaguChek® Pro II byla zjištěna velmi dobrá mezipřístrojová porovnatelnost výsledků. Závěry statistického a grafického vyhodnocení svědčí pro vysokou korelaci mezi výsledky PT-INR i APTT, a to i v oblastech velmi patologických hodnot.
![](/ckfinder/userfiles/files/zkusenosti_z_laboratori/Porovn%C3%A1n%C3%AD%20PT%20a%20aPTT/thumb.png)